無乳鏈球菌探針法熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)使用方法：

一、稀釋PCR陽性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對(duì)照。

2. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11. 產(chǎn)品僅用于科研在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后加）

內(nèi)分泌腺來源血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(EG-VEGF)重組蛋白
內(nèi)凝集蛋白1(ITLN1)重組蛋白
內(nèi)皮素1(EDN1)重組蛋白
內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶1(ECE1)重組蛋白
內(nèi)皮糖蛋白(ENG)重組蛋白
內(nèi)皮細(xì)胞TEK酪氨酸激酶(Tie2)重組蛋白
內(nèi)皮型一氧化氮合酶(NOS3)重組蛋白
內(nèi)皮脂肪酶(LIPG)重組蛋白
內(nèi)臟脂肪特異性絲氨酸蛋白酶抑制因子(Vaspin)重組蛋白
內(nèi)脂素(VF)重組蛋白
鈉/鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶β3肽(ATP1β3)重組蛋白
腦紅蛋白(NGB)重組蛋白
腦型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP7)重組蛋白
腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)重組蛋白
尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(NOX1)重組蛋白
黏病毒耐藥蛋白1(MX1)重組蛋白
尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)重組蛋白
尿激酶型纖溶酶原激活因子受體(uPAR)重組蛋白
尿皮質(zhì)素1(UCN1)重組蛋白
凝溶膠蛋白(GS)重組蛋白
凝血因子Ⅱ(F2)重組蛋白
凝血因子Ⅴ(F5)重組蛋白